传统微生物组研究依赖高通量测序获得相对丰度，但这种方法存在组成性偏倚，即一类微生物相对丰度的增加必然引起其他类相对丰度的下降。研究表明，仅依靠相对数据可能与临床表型产生虚假关联，推到出错误的生物学解释【1】。例如，物种A的相对丰度升高并不一定意味着它的绝对数量增加。相比之下，绝对定量可以直接测量每个样本中的菌体总量和各物种细胞数变化，有助于揭示群落规模的真实变化以及宿主表型关联【2】。

图1. 绝对定量与相对定量结果差异示意图。在本示意图中，两个分类群（分类群 A 和分类群 B）在“健康”状态下相对丰度为50:50，但在“疾病”状态下为相对丰度比例为80:20。出现三种可能的情况：分类群 A 的丰度增加，而分类群 B 保持不变;b 分类群 A 保持不变，而分类群 B 的丰度减少，c 分类群 A 和分类群 B 均减少，但分类群 B 的减少幅度更大【2】。

在医学队列研究中，微生物负荷/载量（microbial load）本身即是一个重要表型指标。利用绝对定量技术，可直接比较不同个体或处理组的菌体数量差异，从而更准确地关联宿主生理表型或干预效应。Nishijima等人在2025年发表的Cell文章，就通过构建机器学习模型，从相对微生物组数据预测粪便中的总菌体数（cells/g），并应用于3.45万例宏基因组数据中。他们发现微生物负荷是驱动人群肠道菌群差异的主要因素，并且与年龄、饮食等多种宿主特征显著相关【3】。这表明在分析菌群与疾病关联时，如果不考虑负荷差异，可能会得出错误结论。类似地，Vandeputte等人在一项纵向研究中也指出：使用相对丰度进行关联分析会引入“组成效应”偏差，而绝对丰度可以揭示菌群变化的方向性和幅度，并与定量性状（如代谢物浓度）更直接相关【4】。

图2. 微生物载量与肠道菌群的分类特征密切相关。A）GALAXY/MicrobLiver（n = 1,894）和 MetaCardis（n = 1,812）研究人群中微生物组的物种水平分类学谱的MDS图。箭头的方向表示每个肠型的中心，长度表示与肠型的相关性强度。B）微生物载量与肠型之间的关联。C）微生物载量与微生物种类相对丰度之间的 Pearson 相关性【3】。

应用实例方面，绝对定量已被用于对照组与疾病组之间的负荷对比。例如有研究在大规模肠癌队列（589例）中同时采用16S测序与定量PCR相结合的方式，发现在考虑肠道蠕动时间和炎症水平等协变量后，微生物负荷差异揭示出的群落变化图景与仅用相对丰度分析时截然不同【5】。总之，通过绝对定量可以量化菌群总量的变化，使研究者获得更完整的群落动态信息，有助于识别关键微生物。

在医学队列研究中，绝对定量还可提高疾病风险预测模型和生物标志物筛选的准确性。研究者发现，将微生物负荷纳入分析，有时能显著改善分类和预测性能。举例来说，Nishijima等（2025）发现，在考虑到不同人群的微生物负荷后，许多之前看似与疾病相关的菌群变化会被重新解释为负荷差异或共变量效应【3】。同样，在肠癌队列中，Tito等（2024）发现，结合绝对定量微生物组分析和严格的协变量控制，可以更可靠地识别与肿瘤进展相关的菌种，而一些广为报道的“癌症相关菌种”的关联在控制了总菌绝对定量之后并不显著【6,7】。这表明，在建立微生物组疾病预测模型时，忽略微生物绝对丰度可能导致假阳性标志物或模型过拟合。未来机器学习模型的构建可以将绝对丰度作为重要特征之一，以提高跨队列的可重复性和预测准确度。

图3. 在微生物组与疾病关系研究新范式中，绝对定量起到关键性作用【7】。

绝对丰度不仅提高了群落变化的定量精度，还为揭示微生物与宿主病理机制间的关系提供了新视角。多界精确定量技术尤其突出地应用于揭示微生物间和跨界的相互作用。Rajan等在2021年Nature文章中，利用多界SpikeSeq方法，在178名早产儿纵向粪便样本中同时量化了细菌、真菌和古菌的绝对定量结果。他们发现细菌和真菌负荷之间存在显著的负相关关系，并通过生态建模和体外/体内实验验证，证明新生菌种（如肠杆菌科）“利用”了先锋种葡萄球菌的生态位【8】。这一结果在传统相对丰度数据中难以观察到，因为相对分析会掩盖不同界群落间数量级上的交互动态。

图3. 绝对定量发现多界间正确的婴儿肠道微生物群落组装结果。a）示意图说明了用于识别婴儿肠道内细菌和真菌动力学的致病驱动因素的广义Lotka-Volterra（gLV）模型。该模型假设每个分类单元的增长率𝑑𝑋𝑖/𝑑𝑡是由其自身的内在增长率r_i、与其他群落成员的相互作用a_ijX_j 以及环境扰动 ε_ikE_k 决定。b）利用绝对定量结果确定了早产儿肠道优势菌之间的微生物-微生物相互作用网络，成功预测出这些网络关系会影响微生物群动力学【8】。

绝对丰度数据使得研究人员能够在生态层面精确量化特定菌株或群落随时间的增减，从而明确病理过程中“谁在增殖、谁在衰亡”。在药物干预、饮食调整或疾病发作等情况下对微生物绝对量的实时监测，有助于推断病理机制。例如，通过比较药物等干预前后不同菌群的绝对变化，可以确定真正的致病或有益菌株，而不是仅仅相对比例变化【9-12】。绝对定量数据的引入促进微生物组学从“谱系表型关联”向“因果机制探索”转变。

绝对定量还有助于解决不同样本或研究之间的可比性问题。在多队列或多中心研究中，样本处理差异（如取样量、DNA提取效率等）往往导致数据难以直接合并。通过加入内标的绝对定量方法来对每个样本进行标准化，可以使不同批次数据更具备可比性【13,14】。这说明基于相对丰度的比较可能掩盖真实的多样性差异，而引入绝对指标则使跨样本比较更加准确。

图4. 不同保存条件下微生物组样品的绝对丰度变化很大。在无保护剂、OMNIgene或Zymo保存液在不同温度下的c) 每个样品单位粪便克数中拟杆菌门和厚壁菌门总数，以及d) 拟杆菌门与厚壁菌门数量的比率【14】。

微生物的绝对定量是近年来微生物组学研究的重大进展之一。通过添加内标、流式细胞计数、qPCR等绝对定量方法，研究者可以获得每个样本的总菌量和各物种真实丰度，以及功能基因的绝对丰度结果，这对于了解微生物负荷、分析病理机制以及构建可靠的疾病预测模型具有关键意义。大量实证研究表明，依赖相对丰度分析时常会引入假象，而绝对丰度数据能够揭示被掩盖的微生物动态。未来，随着实验技术和数据处理方法的不断改进，绝对定量微生物组学必将在医学队列研究中扮演越来越重要的角色，为疾病预防、诊断和治疗提供更丰富的微生物学依据。